基因甲基化研究

DNA甲基化主要形成5 -甲基胞嘧啶(5-mC) 和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA) 及7 -甲基鸟嘌呤
(7-mG)。DNA的甲基化可引起基因的失活，可引|起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白
质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。根据研究水平,甲基化的检测分为三种:基因组甲基化水平
(MethylationContent)的分析,候选基因甲基化的分析以及基因组层次的DNA甲基化模式
(Methylationpattern)与甲基化谱(Methylation Profiling)的分析。

基组甲基化水平的分析主要采用HPLC或高效毛细管电泳法(HPCE) ;候选基因甲基化分析采用甲
基化敏感性限制性内切酶PCR/Southern法、重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性的PCR等方法;铟组范
围的DNA甲基化模式(Methylationpatterm)与甲基化谱(MethylationProfiling)分析方法主要有:限制性标记基
因组扫描、甲基化间区位点扩增等。
甲基化特异性的PCR (Methylation-specific PCR, MSP) :用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未
发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引
物进行PCR。如果用针对处理后甲基化DNA链的引|物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化。             亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP) :该访法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生
甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需股，则尿嘧啶全部
转化成胸腺嘧啶，最后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基
化。此方法是精确度很高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态, 但需要大量的克隆测序,过
程较为繁琐、昂贵。流程如下:
1.基因组DNAA超声打断至100-500bp的片段
2. DNA的片段末端修复、3'端加A碱基,连接测序接头
3.采用EZ DNA Methylattion-Gold kit进行Bisulite处理
4.脱盐处理，PCR扩增后进行文库片段大小选择
5.合格的文库用于上机测序。
高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting, HRM) :在非CpG岛位置设计-对针对亚硫酸氢盐
修饰后的DNA双链的引物，这对引|物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,亚
硫酸氢盐处理后，末甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的
GC含发生改变，从而导致熔解温度的变化。