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基因步移(genomic walking)实验

简要描述:

基步移(genomic walking)实验用以鉴定已经克隆的特定DNA片段侧翼顺序的方法。肥经被鉴腚
的特定DNA片段一端或两端的末端片段为探针去筛选基因组DNA文库, DNA-端或两端并与之重叠的克隆
进行筛选与定。然后用新鉴定克隆中与原始克隆DNA非共有的一端的片股作探针,进行新的筛选与鉴
定。依次类推,可以弄清跨度为几百个kb的连接片段。基铟组步移分为基因组结合文库的染色体步移技术
和基于

更新时间:2021-07-08

基步移(genomic walking)实验用以鉴定已经克隆的特定DNA片段侧翼顺序的方法。肥经被鉴腚
的特定DNA片段一端或两端的末端片段为探针去筛选基因组DNA文库, DNA-端或两端并与之重叠的克隆
进行筛选与定。然后用新鉴定克隆中与原始克隆DNA非共有的一端的片股作探针,进行新的筛选与鉴
定。依次类推,可以弄清跨度为几百个kb的连接片段。基铟组步移分为基因组结合文库的染色体步移技术
和基于PCR扩增的技术。

TAIL-PCR法可用于基因步移研究。该技术通过3个嵌套的特异性弓|物分别和简并弓|物组合进行连续的
PCR循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模
板。该技术省去了诸如:酶切、连接、加尾等传统的基因克隆步骤,且克服了常规PCR不能对已知DNA
列侧翼的位置序列进行扩增的缺点,能快速地分离到目标序列。具有:操作简便成本低、高特异
性、高灵敏性、快速等优点。
TAIL-PCR一般分为三轮PCR反应。第一轮PCR反应 (如图1) 由伍次高退火温度(一 般65°C)的特异
性反应、-次极低退火温度(一 般25°C)的低特异性反应,与由二个腿火温度(一 般65°C)的高特异性
反应与一个低退火温度(一 般44°C) 的低特异性反应所组成的15个热不对称的超级循环构成。通过五次高
特异性的反应,使spI与已知的序列(载体或T-DNA等)退火并延伸,提高目标序列的浓度。一次低特异性的
反应使简粥|物结合到较多的目标序列上,随后进行15次热不对称的超级循环。经过上述反应得到了不同
浓度的三种类型的产物:由特异性弓|物和简并弓|物扩增出的特异性产物和由同一简并引|物或特异引|物扩增
得到的非特异性产物。第二轮PCR反应(如图2)则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板,通过15次
热不对称的超级循环,使特异性的产物被选择性地扩增,腓特异性的产物被压制到极低的含量。第三轮
PCR反应(如图3) 又将第二轮PCR反应的产物稀释1000倍作为模板,-般设置为普通的PCR反应或热不
对称的超级循环。通过上述三轮PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。

 

 

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