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siRNA/shRNA载体构建

简要描述:

siRNA表达载体构建可应用于:(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具;(2)基因组学、细胞信号传导通路分析;(3)药物靶点筛选、疾病治疗。

更新时间:2021-07-07

实验方法原理;多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆 到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆 ,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆 的序列是正确的。

 设计siRNA靶序列;在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列.研究发现对哺乳动物细胞,最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3'端有两个突出碱基的双链RNA;而对非哺乳动物,比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

 

 

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