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质粒提取及原理这些你都知道吗

发布时间:2021-11-03   点击次数:191次

DNA储存着世代相传的遗传信息,被誉为“生命的密码"。从沃森和克里克发现DNA双螺旋结构的那一刻起,DNA的“魔幻之盒"被打开,越来越多不同类型的DNA分子被解密。研究发现,大多数DNA分子呈线性结构,例如人的染色体DNA,如果将单个体细胞中的DNA分子全部展开,长度可达2-3米。然而有一类存在于细菌中的DNA分子却呈环状,穿梭在浩瀚的DNA分子宇宙。虽然它的大小只有细菌染色体的千分之一,却魔力无穷——它就是神奇的“质粒"(plasmid)。

左:细菌染色体DNA的线性结构;右:质粒的环状结构(By User: Spaully on English wikipedia - Own work, CC BY-SA 2.5,

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA分子。

在基因工程领域,质粒常常被当做基因的载体使用。在分子生物学中,质粒 DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。

在质粒DNA的应用过程中,其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响,因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。

在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:

第一步,培养细菌,使质粒扩增;

第二步,进行细菌的收集和裂解;

第三步,质粒 DNA的分离和纯化。

在质粒DNA的提取过程中,其提取效果和其大小呈现出正比例关系,越小越容易进行提取,这主要是由于,如果质粒DNA比较大的话,其特性机会和染色体DNA比较接近,这样想要将二者分离开来难度就会变大。

在进行质粒DNA的分离时,适宜的条件是非常重要的,主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等,在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA 才能够更好的分离开来。

细菌浓度对于质粒 DNA的提取也是非常重要的,如果细菌的浓度比较高,那么在溶菌时,溶菌液很难和细菌液充分混合,导致溶菌不彻底的问题,这样会造成质粒的回收率比较低

而如果细菌溶度比较低,溶菌液和菌液均分混合,会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片,在这样的情况下,沉淀时质粒回合这些物质共沉,进而导致质粒的回收率也会比较低。

在生物学的相关研究之中,细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作,主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等,

下面简单介绍一下碱裂法提取质粒。


原理


细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏,闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离,这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。


只要OH-处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,DNA双链就会再次形成。在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。


在SDS存在的条件下,碱水解是一项非常灵活的技术,它对E. coli的所有菌株都适用,并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

主要试剂的作用原理


氢氧化钠的作用:在碱裂解法中,氢氧化钠的作用原理是使细胞膜由脂双层结构向囊泡化转变,从而使细胞裂解,氢氧化钠的作用既能裂解细胞让细胞内含物释放出来,又是质粒DNA和染色体DNA得以分离的关键。


但是对革兰氏阳性菌来说,提取质粒时不能直接使用碱裂解法,而是先用溶菌酶将肽聚糖层消化,然后才用碱裂解法裂解细胞。这是因为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌细胞壁结构的区别及特点不同。


十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的作用:SDS其实也是一种细胞裂解剂,其裂解细胞的能力比氢氧化钠要弱很多。此处使用SDS是因为SDS通常用作蛋白质的变性剂和助溶剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质的二级和三级结构。


几乎所有的蛋白质能溶解在SDS中,甚至包括疏水和变性的蛋白。DNA提取过程中,SDS使蛋白质变性后与DNA分开。


5mol/L的醋酸钾溶液的作用:醋酸钾溶液不但可以中和之前溶液Ⅱ中的氢氧化钠,还使得溶液的酸碱度剧烈下降,避免染色体DNA长时间暴露于强碱环境而断裂(断裂后就不好去除),又使得质粒可以复性。


此外,SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀。沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。


由于平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。染色体DNA容易被PDS给共沉淀了。


又由于高盐条件也会导致SDS形成沉淀,而5mol/L的醋酸钾本身就是高盐溶液。利用高盐环境促进沉淀的原理,有时也可以利用l0mol/L醋酸铵来代替。

优点


碱裂解法在提取质粒时具有一箭双雕的作用:一方面是将细胞裂解,另一方面是形成高碱性的环境,使染色体DNA和质粒DNA变性,为下一步质粒DNA的复性及与染色体DNA分离做准备。

鉴定


质粒提取以后,采用琼脂糖电泳进行质粒DNA鉴定时,多数情况下能看到三条带,但不是平常看到的超螺旋、线性和开环这三条带。


碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,可以采用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序,分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。


如果不小心在溶液(即NaOH和SDS)加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是,有时候抽提到的质粒会有7-10条带,这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致,这里暂不深究。




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