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亲和力成熟

简要描述:

亲和力成熟是改善抗体和抗原亲和力的过程。异源抗体在人源化的过程中往往伴随着亲和力的下降,体外亲合力成熟的过程包含了引入突变和生物淘选的过程。

更新时间:2020-05-12

亲和力成熟是改善抗体和抗原亲和力的过程。异源抗体在人源化的过程中往往伴随着亲和力的下降,体外亲合力成熟的过程包含了引入突变和生物淘选的过程。

艾柏森生物拥有丰富的抗体亲和力成熟经验,我们通常以scFV形式进行抗体亲和力成熟改造,同时我们也提供单域抗体的亲和力成熟服务。通过随机突变、定位突变等多种突变方式,结合专有人类抗体数据库、电子建模等技术进行抗体亲和力成熟优化。利用整合数据库中针对特异抗原的筛选技术,艾柏森生物提供的抗体亲和力成熟服务可以将scFV抗体的KD提高至10-8-10-9,甚至艾柏森生物曾成功的获取KD为10-12的scFV抗体。

抗体亲和力成熟.1.png

服务流程

 

抗体亲和力成熟.2.png

 

设计亲和力成熟方案

目前主要采用以下几种方式:点突变(定点突变和随机诱变)、CDR区重组、链替换以及DNA重组等手段。艾柏森生物提供基于抗原-抗体相互作用的结构信息开展体外亲和力成熟技术,通过计算机辅助分子模拟确定氨基酸被取代的可能性,预测出氨基酸被取代后产生的结构变化以及如何影响其与靶抗原的结合,并通过噬菌体展示或细胞表面展示技术筛选出具有高亲和力的抗体。

1. 设计scFV突变文库

a. 随机突变法

一般采用易错PCR法在整个VH和VL区引入随机突变。艾柏森生物的突变菌株CD-affiTM能大大增加抗体库基因的多样性。同时也可以采用链替换的方法引入突变。

b. 寡核苷酸定点突变法

当抗体/抗原复合物结构可知或者可以通过计算机技术模拟时采用。

抗体亲和力成熟.3.png

2. 建立噬菌体展示突变库

2.1将全套scFV基因片段连接至pCANTAB5e载体,随后电转化大肠杆菌TG1;同时鉴定ScFv基因库库容(及基因的插入率)。

2.2将辅助噬菌体M13K07加入到转入了ScFv抗体基因的,生长至对数生长期的大肠杆菌中进行噬菌粒拯救。

2.3培养过夜后,离心收集上清即获得噬菌体ScFv抗体库,并对抗体库的滴度进行测定。

3. 噬菌体展示突变抗体库筛选

采用两种纯抗原筛选方式:固相筛选法和液相筛选法经过4轮的淘洗,一般情况下抗体的亲和力可以达到10-8以上。流程示意图见下图。

抗体亲和力成熟.4.png

4. ELISA比较噬菌体展示的人源化scFV和亲本鼠scFV的亲和力

噬菌体扩增— ELISA检测—噬菌体DNA提取—噬菌体DNA测序

5. 人源化scFV的ELISA验证

从以上已测序的结合噬菌体中,挑取5-10株不同序列的噬菌体进行抗体的可溶性表达,并进行ELISA鉴定。

6. 测序

对亲和力较好的scFV进行基因测序,排除FR区包含大量非人源序列的突变体。

7. 亲和力测定

艾柏森生物采用BIAcore system和ForteBio Octet平台,能高效、准确的测定抗体的亲和力。 ForteBio还可以用于过程中定量分析、抗体筛选以及细胞系优化、抗原表位定位、抗体配对等。挑选3-5株克隆,测定抗体和抗原的亲和力。

抗体亲和力成熟.5.png

8. 构建人源化IgG抗体

将人源化scFV抗体的VH和VL通过基因工程的手段分别插入带有人Fc片段基因的哺乳动物细胞表达系统中,表达全长抗体,并进行亲和力测定。

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