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有助于提高蛋白表达目的的实验方案

发布时间:2022-01-19   点击次数:209次
  克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用广泛的蛋白表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BlL21中,在37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
  有助于提高蛋白表达目的的实验方案:
  1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现:
  a.降低培养温度b.使用弱启动子。
  c.使用低拷贝数的质粒表达载体d.降低诱导物的浓度。
  e.在比较高的菌密度进行较短的时间诱导。
  2.改变培养基。
  a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子。
  b.加入缓冲液保持pH稳定c.加入1%的葡萄糖,抑制lac启动子。
  d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子。
  e.加入乙醇,thiols and disulfides等。
  3.分泌表达。使目的蛋白分泌到周质空间。
  周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成,而胞内则是还原性的。周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在,帮助蛋白正确折叠。
  周质空间很少有蛋白酶存在,不会被水解。
  可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。
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