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噬菌体筛选关于噬菌体滴度的测定

发布时间:2020-12-09   点击次数:217次
   展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面,包括绘制抗原表位图谱、研究蛋白质-蛋白质相互作用和鉴定非肽配体的肽模拟型。生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选,也可以在完整细胞上进行淘选。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag,然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体。另外大的蛋白质分子如:抗体、激素、蛋白酶抑制剂、酶和结合蛋白也可展示在噬菌体上,通过对随机突变文库的噬菌体筛选,分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。
  只有当噬菌体的感染复度MOI值远低于1时(即细胞过量时),噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此,建议检测噬菌体贮液的滴度时,在感染前进行稀释,而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。
  1.接种单菌落于5-10 ml LB培养基中,摇床培养至对数中期。
  2.细胞生长时,微波炉融化上层琼脂,分成3 ml等份于灭菌试管中,每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。
  3.37℃预温平板,每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
  4.在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
  建议稀释范围扩增的噬菌体培养物上清10-10;未扩增的淘选洗脱物10-10。每个稀释度换一新鲜吸头,建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
  5.当菌体培养物达对数中期,分成200μl等份于微量离心管中,每个噬菌体稀释度一管。
  6.每管加入10μl不同稀释度的噬菌体,快速震荡混匀,室温温育1-5 min。
  7.将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中,每次一管,快速混匀,立即倾注于37℃预温的平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
  8.待平板冷却5 min后,倒置于37℃培养过夜。
  9.检查平板,计数有~10个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
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