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蛋白表达纯化有关天然蛋白质的三个关键参数

发布时间:2020-11-05   点击次数:23次
   对重组蛋白表达的常见问题是真核蛋白在细菌中表达时倾向于不溶。变性、聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵体,需要进一步纯化和重折叠,这可能是低效的和不完全的。
  与天然蛋白质表达的三个关键参数:
  1.IPTG浓度
  有可能宿主中的蛋白表达将通过lac操纵子系统操作。这个系统的详细解释可以在别处找到,加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),一种乳糖类似物,控制蛋白的表达。蛋白的表达应处于生长的对数期,即当溶液的波长600(OD 600)处的光密度达到0.4-0.6。如果目标是可溶性蛋白质,不要改变细胞中蛋白的折叠功能。已经假定不溶性蛋白可能是由于分子伴侣的存在。因此,使用高浓度的IPTG(>1mM)可能不总是产生好的结果。尝试几个不同的浓度,看看哪一个给高的可溶性蛋白的产量。
  2.温度
  偶尔可以在37℃的典型温度下,通过生长和诱导分离可溶性形式的蛋白质,但通常情况下,溶解度在较低温度下增强。可尝试在30℃,25℃和18℃下进行诱导。
  注意:如果首先在37℃生长,先让培养物冷却到诱导温度,再加入IPTG。
  3.诱导时间
  更长并不总是更好。对于对宿主有毒的蛋白尤其如此。在诱导期间,每隔几个小时取样,并检查目的蛋白的表达。典型的诱导时间根据温度而变化,对于37℃,尝试4小时;对于30℃,进行5-6小时,并且任何低于25℃的温度应该允许生长过夜。

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