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蛋白表达实验过程可能遇到的常见问题分析

发布时间:2021-01-08   点击次数:298次
   蛋白表达实验过程可能遇到的常见问题有哪些呢?我们应该怎么处理呢?
  一、蛋白不表达或表达量很低?
  1.选择正确的表达载体和表达菌株
  T7启动子的载体应选用BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Transetta(DE3)等菌株。非T7启动子的表达载体应选用BL21表达菌株。
  2.尝试不同的表达载体与菌株
  不同的蛋白,对不同载体与菌株的偏好不同,如果某一表达蛋白无法通过优化诱导表达条件得到明显改善,可以更换其他菌株或表达载体。
  3.表达条件的优化
  选择不同的培养基。对于某些蛋白,在培养基中加入适量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明显提高表达量。
  较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间,一般可以加快表达的速度,促进目的蛋白的积累,从而提高表达量。但可能会降低可溶蛋白的表达量,形成包涵体。
  细胞的生长状态对蛋白表达有很大的影响,可以通过测量菌液的OD600值监测生长状态。对于大部分蛋白,应在菌株的对数生长期(OD600=0.5)进行诱导。
  二、目的蛋白大小不正确?
  蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白,从而准确判断蛋白大小。确认蛋白表达是否完整,蛋白是否提前终止表达。若形成二聚体甚至多聚体,可以通过加热变性蛋白打开二硫键(加入DTT、β-ME等还原剂)等手段,破坏次级结构,准确判断分子量大小。
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