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酵母蛋白表达的关键因素解读

发布时间:2020-10-19   点击次数:29次
   原核蛋白表达系统既是常用的表达系统,也是经济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表,具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点,缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制,如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠,得到具有生物活性的蛋白的几率较小。
  酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表,具有表达量高,可诱导,糖基化机制接近高等真核生物,分泌蛋白易纯化,易实现高密发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解,表达量不可控。
  酵母蛋白表达的几大关键因素:
  1.表达载体
  首先,甲醇酵母中没有稳定的质粒,所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子,醇氧化酶的产量高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%,所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次,在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体,一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷,另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解,pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外,使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体,形成多个表达单元,产生高产的菌株,此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
  2.受体菌
  在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时,甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为单独碳源时,诱导基因表达,使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件,细胞干重达100g/L以上,蛋白质产量极高。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型,从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
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