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大肠杆菌蛋白表达系统

简要描述:

大肠杆菌表达系统简介
1. 代谢途径和基因表达调控机制比较清楚

1) 全基因组测序,共有4405个开放性阅读框架;

2) 基因克隆表达系统成熟完善;

3) 繁殖迅速,培养简单,操作方便,遗传稳定。

更新时间:2020-05-12

大肠杆菌表达系统简介

1. 代谢途径和基因表达调控机制比较清楚

 1) 全基因组测序,共有4405个开放性阅读框架;

 2) 基因克隆表达系统成熟完善;

 3) 繁殖迅速,培养简单,操作方便,遗传稳定。

2. 培养周期短

 1) 大肠杆菌繁殖能力强,在营养条件充足时,20~30mins即可繁殖一代;

 2) 大规模发酵成本低,具有巨大的生存潜力。

3. 目标基因表达水平高

 表达水平较一般真核表达系统高,某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5%~30%。

4. 遗传背景清楚

 1) 对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究相当清楚,已有多种不同的抗药性、不同营养缺陷型和不同校正突变型的菌株供选择使用;

 2) 可以根据不同的载体而选择不同的菌株。

5. 抗污染能力强,下游工艺简单,易于控制。

6. 已有大量可供选择利用的表达载体,被美国FDA批准为安全的基因工程受体菌。

艾柏森生物大肠杆菌表达系统优势

1. 艾柏森生物大肠杆菌可溶性表达成功率高达95%;

2. 艾柏森生物可以提供多种大肠杆菌表达载体,pET28b、pET22b、pGEX-6P-1等。

3. 多种大肠杆菌表达宿主,标准表达菌株BL21,可增强表达蛋白的菌株T7E,表达毒性蛋白的C41,增强蛋白可溶性表达的超低温菌株Arctic,以及其他经过艾柏森生物分子技术团队改造过的表达菌株,可以满足客户的不同需求。

4. 表达系统的优化。通过对表达系统进行优化,很大程度上解决蛋白不表达和包涵体的问题,如表达载体与表达菌株相容性测试、诱导表达条件的优化、复性等。

服务组合

服务项目 (Service Items)周期(周) Time(weeks)
蛋白分析与密码子优化项目开始前完成
基因合成2~4
载体构建1
基因表达纯化测试2
1L发酵表达及纯化2
切标签2
大规模的发酵与纯化以项目需要为准
总计8~10

 

注:

1)表达纯化测试一般包括2种载体,3种表达菌株,2个表达温度,12个条件的测试,根据客户的前期实验结果,有可能调整或缩短试验周期;

2)我们可提供的备选优化条件如下:

 

表达载体pET28bpET32apGEX-6p-1pET22bpBADpTrcHis等
表达菌株ArcticBL21(DE3)OrigamiRosettaT7 Expresss
表达温度16℃30℃37℃

 

经典案例

以某原核蛋白为例:

1. 优化表达体系,包括苏朱军、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度及培养基。

 

宿主菌诱导温度诱导时间诱导剂培养基
T7E,BL21,C41,Arctic30℃/37℃1h/4hIPTG自诱导LB/定制/同位素/自诱导

 

经过3轮优化,我们选择了BL21+pGEX-6p-1组合,并发现温度对与目标蛋白的表达影响最大,如图一

 

 

图一:融合蛋白小试SDS-PAGE分析图

M:ProteinMarker;:诱导前总蛋白;

2:20℃上清;3:20℃沉淀;4:37℃上清;5:37℃沉淀。

2. 在确定了表达条件后,我们对蛋白进行了GST琼脂糖亲和层析尝试纯化,如图二,

 

      

 

图二:GST琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图

M:Protein marker;S:上样;F:流出;1:20mM GSH洗脱组分;

3. 在确定纯化效率可以接受的条件下,我们对蛋白进行了大体积发酵,并最终纯化SDS-PAGE分析,如图三,融合蛋白经过纯化,SDS-PAGE电泳分析在相应位置出现明显条带,表明目的蛋白成功得到了纯化。

 

 

 

图三:蛋白最终纯化SDS-PAGE分析图

M:Protein marker;1:目的蛋白

4. 蛋白浓度测定

采用SK3071 非干扰型蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度为1.06mg/mL,待测样品体积为10μL,结果如下:

 

 

 

 

测试1测试2平均值BSAμg
0.9390.9390.9390
0.8750.8740.87458
0.8080.8040.80616
0.740.7460.74324
0.6180.6160.61740
0.8550.8490.85250
0.8910.8780.8845目的蛋白

图四:蛋白浓度测定

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