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如何对包涵体蛋白进行表达与复性

更新时间：2022-01-18 点击次数：1147次

关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。

一、包涵体蛋白的表达

在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。

二、包涵体的洗涤
在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，w=0.5％TritonX-100，pH 8.0；37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。

三、包涵体的溶解
洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8.0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。

四、包涵体的复性
包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。

1.包涵体的稀释复性
设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。

2.包涵体的透析复性
包涵体蛋白的复性将8 mol/L 尿素溶解后的样品装入透析袋，密封置于复性液I（0.2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L NaCl；5%甘油；5 μmol/L EDTA；pH8.5），4 ℃ 透析12 h 后再转入复性液II（0.2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L NaCl；）4 ℃ 透析12 h，12000 r/min 离心30 min，收集上清进行蛋白浓度及活性测定。

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