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【干货分享】细胞转染攻略

发布时间:2021-08-24   点击次数:105次

转染(Transfection) ,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。

转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。

转染的类型

1)根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短,可以分为瞬转和稳转。



2)根据转染方式可以分为化学,生物,物理方法。



脂质体转染法简单快捷且不需要其他仪器辅助的综合考虑,一般是实验室的常客,所以接下来先给大家介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤。


脂质体转染法

脂质体(Liposome)转染方法原理



脂质体作为体内和体外输送载体的工具,已经研究的十分广泛,中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。



优点:

与其它方法相比,有较高的效率和较好的重复性,它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下zui方便的转染方法之一。


脂质体转染操作步骤

进行实验之前,请先规划好实验,一般细胞转染需要24h-72h,所以要充分了解细胞生长速度,计算所需脂质体和DNA的储备量,并确认准备好所需试剂:Opti-MEM无血清培养基,Lipofectamine转染试剂,以及DNA,这个一定要确认好。


1、细胞铺板

(1)一般会选择复苏细胞传代3-4次(汇合率达到90%之前对细胞进行传代,不要长到100%),从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染,传代次数高(>30-40)时,细胞的生长速度和形态会改变。

(2)如果提总蛋白,一般选择六孔板进行转染,因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug,一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。

(3)传代条件取决于所用的细胞系。对于快速生长的细胞,倍增时间为16小时(如HEK293)。对于生长缓慢的细胞,倍增时间为36小时(如原代细胞)。

(4)转染当天,将细胞铺板。如果在转染前一天或更早时间铺板,转染效率可能下降,如果是简单细胞系的转染,可以直接在前一天晚上铺板,第二天来转染。转染时,细胞密度会影响转染效率,细胞密度保持在汇合率为70-90%(这个前提是转染24h,如果转染48h则需要汇合率为50-70%),细胞的铺板和转染也可同时进行。


2、细胞转染

吸去培养皿中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。更换无血清培养基。准备转染制备液,用灭菌后的EP管制备。以六孔板为例,A液:用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒;B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000,分别将A液、B液轻轻混匀,静置5min,吸取B液加入至A液中,轻轻混匀,室温静置20min。加入转染试剂到每个孔的培养基中,6h后,更换成完全培养基,继续培养到24-48小时(不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同,转染前,应该摸一个最佳配比。质粒:脂质体=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例来检测最佳转染比例,一般质粒有带荧光,可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率)。以下为不同规格的培养板需要加DNA和lipo2000的量。



转染时,应使用优质质粒:

1、通过测量OD 值来确定DNA纯度和浓度,测得的OD值应介于1.7-1.9之间。脂质体转染基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

2、含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。

转染时,小心轻柔的将lipo2000加到培养基中并轻轻混匀,避免粗暴用力吹打,会导致脂质体失效。


血清一度曾被认为会降低转染效率,老一代的转染方法往往要求转染前后用PBS洗细胞然后在无血清培养基条件下转染,但有些对此敏感的细胞会受到损伤,甚至死亡(比如贴壁较差的细胞,在PBS洗涤时很容易冲刷细胞)导致转染效率极低。不过转染产品配方几经革新后的今天,对于主流的转染试剂来说,血清的存在已经不会影响转染效率,甚至还有助于提高转染效率,但是血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成,在DNA-转染复合物形成时需用无血清培养基opti-MEM来稀释DNA和转染试剂,在转染过程中是可以使用血清的。转染后6小时更换培养基,因为lipo2000具有一定毒性。

细胞培养过程中往往会添加抗生素来预防污染,但是抗生素可能对转染造成困扰。比如青霉素和链霉素,青链霉素是我们常用来预防污染的抗生素,就会影响转染,虽然这些抗生素一般情况下对于真核细胞无毒,但当转染试剂增加了细胞的通透性时,就会使抗生素也进入细胞从而间接导致细胞死亡,造成转染效率低。目前转染试剂有些已经可以全程都用有血清和抗生素的完全培养基来操作,非常方便,省去了污染等麻烦。


3、观察转染的效果

在转染后24小时,用荧光显微镜观察实验结果并记录荧光蛋白表达情况,如下图所示,说明转染成功,且转染效率还可以,如果不带有荧光,可以用GFP来对照,可以放在一个单独的孔中,或是与目标质粒共转染,同时用Q-PCR和者WB来检测。



转染后发现转染效率不高,可以通过两种方法:

1、复转染,即转染后12-24小时再次进行转染,前提是该细胞对脂质体的耐受性较好,转染后细胞死亡数较少。

2、通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。

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无细胞表达系统是一种以外源DNA或mRNA为模板, 利用细胞抽提物中的细胞合成机器,白折叠銦子及其他相关酶系,通过添加氨基酸和T7聚合酶和能量物质来实现蛋白表达的体外系统。中包括真核无细胞表达系统和原核无细胞表达系统。无细胞表达系统的优势

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节省时间:表达蛋白可以直接用于后续实验,不需要额外纯化。

更适用于激酶等毒性蛋白的表达、也可使用经过修饰的tRNA来进行标记,在某特定位点掺入天然的氨基酸。

一个系统,多重应用:表达的蛋可于白-伯互作实验;白核酸互作实验,白修饰等多种特征分析。

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