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噬菌体的分离与纯化

发布时间:2021-08-24   点击次数:87次

实验原理

噬菌体感染宿主细胞后,其DNA(或RNA)在细胞体内进行复制、转录,相关基因表达,装配成完整的噬菌体颗粒,最后裂解宿主细胞或通过挤出方式从宿主细胞(宿主细胞不被杀死,如M1噬菌体)中释放出来。因此,①在液体培养基中可使浑浊的菌悬液变为清亮或较清亮。利用噬

菌体的这种特性,在样品中加入敏感菌株与液体培养基混合后培养,噬菌体便能大量增殖,释放,从而可分离到特定的噬菌体。②在有宿主细菌生长的软琼脂平板上,噬菌体可裂解细菌或限制被染细菌的生长,形成透明的或浑浊的空斑,亦称噬菌斑。--个噬菌体产生一个噬菌斑,利用这种现象可将分离获得的噬菌体进行纯化。

 

三、实验用具及材料

1.菌种:大肠杆菌

2.试剂:氯仿

3.培养基:

液体牛肉膏培养基:胰蛋白胨2g,牛肉膏0.6 g,NaCl 1g,加H20至200mL,pH7. 4,121 °C20min 高压灭菌。

 

3X牛肉膏培养液:胰蛋白陈3g,牛肉膏0. 9g,NaCl 1.5g, 加H20至100mL,pH7. 4,121 °C20min 高压灭菌。

 

固体牛肉膏培养基:每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉,121 °C20min高压灭菌。

 

半固体牛肉膏培养基:每100mL液体牛肉膏培养基加入0. 7g琼脂粉,121 °C20min高压灭菌。

 

4.仪器及其他用品:无菌小试管、无菌吸管、玻璃涂棒、无菌细菌过滤器(孔径0.22um),恒温水浴锅等。

 

5. 阴沟污水

 

四、实验步骤

1.噬菌体的分离

(1)制备菌悬液:用接种环在斜面.上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液的试管中,混合均匀后置37°C培养过夜

(2)增殖培养:在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基大的三角烧瓶中加入阴沟污水20mL和大肠杆菌过夜培养物0.3mL,混合后置37C振荡培养12~24h

(3)制备裂解液:将上述混合培养物倒入一支50mL无菌离心管中,经4000r/min离心15min;将上清液小心的转入另一无菌离心管中,所得裂解液经37°C培养过夜,以作无菌检查,此为噬菌体裂解液;还可加入几滴氯仿,稍作混合,备用

 

(4) 噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板.上加入0.1mL大肠杆菌菌液,用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂布在培养基表面.上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上,置37°C培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑,便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体

 

2. 噬菌体的纯化

(1)取_上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于- -支无菌试管中,再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌培养物,混合均匀;

(2)取_上层琼脂培养基溶化并冷却至55°C (可预先溶化后置50~55°C水浴锅内保温备用),加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物,混匀后快速倒入含地层培养进的平板上,铺匀,置37°C培养24h;

(3)取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征(如噬菌斑形状、大小、清亮程度等)。此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体,需进一步纯化;

(4)纯化时,通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一.下,蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中,置37°C振荡培养,直至试管中菌悬液由浑浊变清;培养物经离心后取上清液,再重复步骤(2)、(3)直到出现的噬菌斑形态一致为止

 

五、实验结果

仔细观察和比较平板上出现的不同噬菌斑的形态特性并绘图

六、注意事项

1.使用仪器要保证是无菌的;

2.注意琼脂的浓度;

3.氯仿是易燃品,应远离火焰

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●抗体库的滴度测定:取少量上述获得的噬菌体ScFv抗体库,梯度稀释后进行噬斑培养实验,观察噬斑生长情况以判断噬菌体ScFv抗体库的滴度;

●噬菌体抗体库的富集筛选:使用靶标抗原包被酶联板,加入噬菌体抗体进行孵育,随后进行洗板、洗脱;将洗脱下来的噬菌体抗体进行中和后,再次感染细菌,并进行第二轮的淘洗; 共进行3轮淘洗,每一轮洗脱后都进行滴度测定;后-轮筛选时,设BSA包被的对照组以确定是否富集了大量抗BSA的噬菌体抗体。

噬菌体展示技术服务项目:抗体筛选

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