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解救你的细胞污染

发布时间:2021-08-11   点击次数:61次

我们在进行细胞实验时,或多或少都经历过细胞污染的情况,一旦出现细胞污染的情况,全部细胞扔掉难免觉得可惜,之前花的时间、精力也全部打了水漂。


硬着头皮接着往下做,做出的结果也缺乏说服力,还可能使污染情况更加严重。

细胞污染情况复杂,通常认为的细胞污染都是微生物污染。但是凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。

细胞污染不能完全被消除,但能减少其发生的频率和后果的严重性。细胞污染根据污染源主要可以分为物理性,化学性和生物性污染。



一、物理性污染的来源、危害及预防


物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分,从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素,如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。

细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中,可以引起细胞代谢发生改变,如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。

细胞培养箱应放在温度较恒定的环境中,周围不能放置能引起机械振动的设备,如离心机等。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验,以避免过冷的温度对细胞的影响。



二、化学性污染的来源、危害及预防


培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长,某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。

未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分若浓度超过了合适的范围,也会对细胞产生毒性。

同样,不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的,在培养中应严格控制。

动物血清是细胞培养中常用的天然培养基,但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物,而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同,因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。

血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时,为了保证实验的可重复性,最好选用同一批次的血清。

培养液、培养附加成分、试剂培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。



三、微生物污染


由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力,而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的,因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。

一般在细胞受到污染早期或污染较轻时,能及时处理并除去污染物,部分细胞还有可能得到挽救。但当细胞持续在污染环境中生长时,轻者细胞生长缓慢;较重的细胞增殖停止,细胞质中出现大量堆积物,细胞变圆或崩解,从瓶壁脱落。

不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别,微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的,缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速,能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。

芽孢杆菌、葡萄球菌是细菌污染的主要菌属,污染的主要特征为培养基变黄、浑浊,低倍镜下呈沙粒状布满细胞间隙或培养基,高倍镜下可见杆状或球状的细菌在培养基中游动。





常见的真菌污染是白色念珠菌污染,污染后培养基无明显浑浊和变色,镜下可见排列成串珠状的球形真菌,污染严重时可见念珠菌连成片状或团状。真菌的运动能力较弱,镜下一般看不到运动。





霉菌污染时培养基一般也不变浑浊,颜色变化也不明显,但肉眼可见漂浮的白色菌落,显微镜下可看到树枝状的菌丝。





支原体在镜下无法看到,因而支原体污染时只能看到细胞状态明显变差却没有其他微生物污染的迹象,此时可通过PCR检测确定。

还有一种被称之为“黑胶虫"的污染,在显微镜下观察呈一粒一粒小黑点,成布朗运动,会阻碍细胞正常生长,对于这个说法众说纷纭,有人说其就是细胞碎片(并不是它影响了细胞状态,而是细胞状态发生变化出现了黑胶虫增多);有人说这是玻璃培养瓶中的硅颗粒;有人认为这是支原体污染(可穿过滤膜,可空气传播);有认为是真菌污染的;也有说是寄生类原虫污染的……

但也没有一个明确的研究能够证实这种情况,众多的研究只是在验证这些猜想,现在也没有一个明确的说法。


那么

如何急救呢?


01

判断污染源

一旦发现细胞有污染的迹象或已污染,需要立即对污染源进行判断:有无操作不当?培养基、胰酶、PBS等颜色、澄清度是否正常?

02

及时处理

若确定现有的培养基、胰酶、PBS可用,则继续使用;若无法确定则新配完全培养基、PBS、胰酶,原有的液体在确定是否污染后再做处理。

以贴壁细胞为例

对细菌污染细胞进行急救:

1

立即弃去培养容器内的培养基,以PBS润洗2~3次,加入胰酶处理至细胞形态略有改变但未脱离容器时弃去胰酶,加入PBS轻轻润洗1遍;

2

加入20×双抗,浸泡细胞3~5min,弃去双抗;

3

加入新鲜的完全培养基(含10×双抗)培养12h;

4

12h弃去培养基以PBS润洗2~3遍后加入完全培养基(含10×双抗);

5

传代时以较小转速离心(如平时以1000r/min离心,则可降为800~900r/min离心),仍以含10×双抗的培养基培养;

6

若第二代后镜下找不到细菌,则第三代起可正常培养。正常培养48h后无反弹则可认为污染已清除。


若为霉菌污染,在以PBS润洗2~3遍后换液,无需加入高浓度双抗。培养48h后污染未再次出现即可。

若为真菌污染,在PBS润洗、换液后可加入两性霉素B(两性霉素B有细胞毒性,不推荐使用),也可加入300μg/mL氟康唑培养,污染控制后改用150μg/mL培养2~3代。

若怀疑支原体污染,则可进行PCR检测或直接使用支原体清除试剂。也可购买环丙沙星注射液,于超净台内打开直接添加到培养基中,以20μg/mL浓度2代后改用10μg/mL浓度持续培养约2周。

当然,最优解的方案还是复苏更换新的细胞进行实验。最后祝愿大家都能培养健康正常的细胞


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