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单抗制备的生产及纯化方法

更新时间:2022-09-13点击次数:702
  抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
 
  单抗制备的生产及纯化方法:
 
  (1)动物体内生产单抗
 
  ①成年BALB/c小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡,每只小鼠0.3-0.5ml。
 
  ②7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞,每只小鼠5×105/0.2ml。
 
  ③间隔5天后,每天观察小鼠腹水产生情况,如腹部明显膨大,以手触摸时,皮肤有紧张感,即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水。
 
  ④将腹水离心(2000r/min5分钟),除去细胞成分和其他的沉淀物,收集上清,测定抗体效价,分装,70℃冻存备用。
 
  (2)单克隆抗体的纯化(辛酸-硫酸铵沉淀法)
 
  ①腹水4℃12000rpm离心15min,去除杂质。
 
  ②取1份腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸缓冲液,按每毫升稀释腹水加33ul辛酸的比例,室温搅拌下逐滴加入辛酸,室温混合30min。
 
  ③4℃静置2小时,取出12000g离心30分钟,弃沉淀。
 
  ④上清经尼龙筛过滤,于50倍体积的0.01MPH7.4PBS中4℃透析6h。
 
  ⑤在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。
 
  ⑥4℃静置1h以上,10000g离心30分钟,弃上清。
 
  ⑦沉淀溶于适量PBS(含137mmol/LNaCl,2.6mol/LKCl,0.2mmol/L EDTA)中,于50-100倍体积的PBS中透析过夜。
 
  ⑧取少量透析后样品适当稀释后,以紫外分光光度计检测蛋白含量,SDS-PAGE,抗体纯度。
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