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单克隆抗体药物生产中细胞培养对抗体糖基化的影响

发布时间:2021-12-22   点击次数:260次

1986年,世界shouge单克隆抗体药物——抗CD3单抗OKT3获得美国食品和药物管理局(FDA)的上市批准,单克隆抗体药物产业化从此拉开序幕。作为主要应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病等治疗领域的抗体类药物,目前,全球已经批准的单克隆抗体药物超过了80个,年销售额增长率超过30%,单克隆抗体在生物制药领域发展得越来越快。随着抗体工程的发展,嵌合单克隆抗体以及人源化单克隆抗体相继问世,而以B淋巴细胞cDNA库和噬菌体展示技术的发展使全人源单克隆抗体成为可能,第一支全人源单克隆抗体——阿达木单抗(adalimumab)已成功研制并于2002年由FDA批准上市。全人源单克隆抗体具有良好的功效,且无fu作用,已成为当前发展最迅速的一类单克隆抗体药物。

单克隆抗体药物及其糖基化修饰简介

单克隆抗体是蛋白类大分子,具有复杂的结构特征,主要由Fab和Fc两大功能区组成,在Fab段和Fc段特定的位点存在糖基化修饰。糖基化修饰形成的糖链仅仅占整个单克隆抗体的3%,尽管比例不高,但糖链结构却发挥着极其重要的作用:能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构,研究表明抗体脱糖基化后对热的稳定性大大降低;糖链结构还能保护抗体不受某些蛋白酶水解;糖链中特别的糖型还与免疫效应功能密切相关,糖型并非在人体内生物合成,因此可能具有一定的免疫原性,可加速单抗的血浆清除。总的来说,糖基化修饰不仅对维持单克隆抗体的结构有重要作用,同时一些特定的糖基化修饰类型以及不同的糖基化修饰程度均会影响抗体的安全性特征,而且,糖基化修饰也影响药物的有效性。

单克隆抗体药物的糖基化具有高度的异质性,在单克隆抗体的糖基化中,由于糖基化种类的多样性以及连接方式的多样性,因而形成了自然界中最复杂和最多样化的蛋白结构。单克隆抗体药物的糖基化结构对于药物的疗效和安全具有重要意义。

 

图1:IgG的结构示意图

有趣的是,尽管单克隆抗体药物的轻链和重链的氨基酸序列是对称的,但是Fc片段上N端糖基化修饰并非全部都为对称。单抗药物的N端糖基化修饰通常是复杂的双天线糖链结构,可能发生岩藻糖化和唾液酸化。通过表1,也可以看到单克隆抗体药物常见糖基化修饰对抗体药物结构和功能有着很大的的影响。

表1:抗体药物常见糖基化修饰及其对抗体药物结构和功能的影响


研究发现糖链中不同末端糖基化对IgG功能有不同的影响,IgG因不同的连接方式存在3种不同类型的N端糖型,分别为高甘露糖型、甘露糖杂合型、甘露糖复杂型,大多数的杂合型和复杂型存在核心岩藻糖基化,少数没有。


图2 3种不同类型的N端糖型

所以说单克隆抗体药物糖基化对于其疗效及生产就显得极为重要,各大生产商都非常重视单克隆抗体药物糖基化的质量监控。在抗体药物生产过程中shouxuan哺乳动物细胞表达系统,在哺乳动物细胞表达系统中因其具有天然蛋白的加工机制,当然也包括了抗体蛋白的糖基化修饰,这样所生产出来的单克隆药物就与天然的蛋白十分接近,并且保证了治疗效果。单克隆药物的糖基化修饰主要是由寡糖连接到天冬酰胺的侧链,即N-连接,或者连接到丝氨酸/苏氨酸连接,即O-连接,如上文中提到的连接形式及种类。N端或者O端的多糖会影响单克隆抗体药物的蛋白活性,同时也决定了此种单克隆抗体药物在体内的半衰期。正是因为这些特点,抗体药物的糖型及糖基化修饰备受药品监管部门的重视,力求达到质量标准,以确保其有效性和安全性。


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细胞培养对抗体糖基化的影响


在细胞培养过程中,决定单克隆抗体糖基化的主要因素有细胞表达系统、培养模式、生产工艺、培养基等,这几个方面都会改变抗体糖基化修饰,对单克隆抗体研究及生产等相关研究带来了巨大挑战。表2列举了细胞培养过程中影响抗体蛋白糖基化的各种变量。 

表2 细胞培养过程中影响抗体蛋白糖基化的变量汇总


接下来我们将重点对细胞表达系统、培养模式、 生产工艺、 培养基等影响蛋白药物糖基化的研究进行总结。

2.1 表达系统对抗体药物糖基化修饰的影响

在抗体药物研发阶段,研究细胞表达系统对糖基化的影响十分关键。目前,商业化生产抗体药物的细胞表达系统主要是CHO细胞,少部分使用SP2/0、人纤维肉瘤细胞、人类淋巴母细胞、小鼠骨髓瘤细胞等。有报道表明CHO悬浮细胞表达人β-干扰素与微载体贴壁CHO细胞表达的干扰素具有相同的糖型。由相同组织分离的细胞表达的功能性酶种类也是多样化的,从而表达糖基化蛋白的能力也不同。CHO细胞中CHO-K1和 DUKX-B11都含有未激活的α(1,3)GalT基因,同样都有低水平的NGNA,CHO细胞表达系统在生产抗体药物时对糖基化修饰的影响是zui普遍的。

CHO细胞表达糖基化的机制同人类的IgG糖基化作用机制十分相似,仅有一些微小的不同之处。据报道,人的IgG末端唾液酸残基以α-2,6连接,CHO细胞来源的抗体以α-2,3连接。无论是人的IgG,还是CHO细胞表达来源的抗体,末端唾液酸残基的含量都很低。因此,唾液酸残基连接的不同对产品的质量可能不会造成影响。而且,许多人类血清糖蛋白也含有α-2,3连接的唾液酸残基。

因此可见,宿主细胞系极大地影响了单克隆抗体的糖基化修饰类型,进而影响单克隆抗体治疗相关的安全性。对于生物制药产业来说,选择合适的宿主细胞系可以优化并控制糖基化修饰,进而提高产品的质量。

2.2 培养模式对抗体药物糖基化修饰的影响

细胞培养方式常见的有三种:批次培养、分批补料培养、灌流培养。不同的细胞培养方式会明显影响单克隆抗体药物的糖基化修饰,在灌流培养模式下糖基化总体水平较分批补料培养模式下的唾液酸化有所增加。总体来说,连续灌流培养的糖基化程度较批次培养要高,而批次培养模式下的细胞增长速度快,灌流培养模式下细胞生长速度越慢糖基化程度越高。当然选择哪一种培养方式取决于所生产的抗体药物自身糖基化情况。


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