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质粒DNA提取实验

发布时间:2021-11-29   点击次数:208次

在我们的细胞实验中经常会用到质粒DNA,那么具体是怎么来的呢?今天讲的是DNA的提取步骤。

前提 : 细菌繁殖步骤(挑单克隆,置于LB培养基中,置于37℃恒温摇床摇过夜,180-200 rpm)。

一般市面上有很多试剂盒可供大家使用,大体步骤都差不多的啦~~我按照我所使用的试剂盒(AxyPrep中抽试剂盒)的步骤分享如下:

收集1. 50 ml离心管收集过夜摇菌的LB培养液(此时可以做一下判断,如果液体未变浑浊,说明细菌并未繁殖成功,这样肯定难以提出DNA;如果液体浑浊,便说明细菌繁殖成功啦,可继续下面的操作),6000 g离心8 min,弃上清。

裂解2. 加250 μl Buffer S1 重悬细菌的沉淀,可以在涡旋仪上涡旋,使得沉淀全部重悬均匀,不留有小的菌块。 3. 加250 μl Buffer S2,温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。

中和4. 加350 μl Buffer S3,温和并充分地上下翻转混合6-8次,12,000×g离心10 min。 5. 质粒DNA制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管中, 开启并调节负压至-20-30英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。

结合6. 加500 μl Buffer W1,吸尽管中溶液。 7. 加700 μl Buffer W2,吸尽管中溶液;以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。

洗涤8. 将制备管置于2 ml离心管(试剂盒内提供)中,12,000×g离心1 min。

洗脱9. 将制备管移入新的1.5 ml离心管(试剂盒内提供)中,在制备管膜中央加60-80 μl Eluent或去离子水,室温静置1 min。12,000×g离心1 min。 将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。10. 最后去检测其浓度即可啦。

之前也用过其他的试剂盒,步骤大同小异,根据说明书步骤操作就可以了,这个实验比较简单的啦。


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