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蛋白表达是什么?

发布时间:2021-10-13   点击次数:12次
  大肠杆菌是目前应用广泛的蛋白表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电冰进行分析。
  蛋白表达操作步骤:
  一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
  1.接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL.21菌株于5mL.LB液体培养基中(含100ug/ml氨苄青霉素),37C震荡培养过夜。
  2.转接lml过夜培养物于100mL(含100ug/l.氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至0D600=0.6-0.8。取10u1样品用于SDS-PAGE分析。
  3.加入IPTG至终浓度0.5mmol/1,37℃继续培养1-3h.
  4.12,000rpm离心10min,弃上清,菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
  二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离,纯化
  1.NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1ml.NTA介质,并分别用8l去离子水,8mL.上样缓冲液洗涤。
  2.重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5ml.上样缓冲液,用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60min,4℃12000rpm离心30min,将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10u1上清样品用于SDS-PAGE分析。
  3.上清样品以10-15ml./h流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10u1样品用于SDS-PAGE分析。
  4.洗脱杂蛋白:用Washing Buffer以10-15ml./h流速洗柱,直至0D280=0.01.分步收集洗脱液,约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE分析。
  5.洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1l.级分,分别取10u1样品用于SDS-PAGE分析。
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