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技术服务|纳米抗体亲和力成熟服务

发布时间:2021-09-13   点击次数:61次
1993年,比利时布鲁塞尔自由大学免疫学家Hamers-Casterman教授以及他的同事们在骆驼(骆驼科,后来研究证实也包括单峰骆驼和羊驼)的血清中发现了一种与传统抗体结构不同的新型抗体,这种抗体仅仅由两条重链构成,被称为重链抗体(heavy-chain antibody, HCAb)。重链抗体的重链的可变区称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody),通过体外重组表达制备的VHH分子质量仅仅为15kDa,是传统抗体的十分之一左右,是抗原结合片段(scFV,VH-VL)的二分之一左右,因此被称为纳米抗体(nanobody, Nb)。

纳米抗体优势

纳米抗体诸多方面均优于传统抗体  。基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构,兼具了传统抗体与小分子药物的优势,几乎wangmei克服了传统抗体的开发周期长,稳定性较低,保存条件苛刻等缺陷,逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。相比于常规抗体,纳米抗体的优势有:
1.分子量小,可穿透血脑屏障;
2.原核或真核系统中高表达;
3.特异性强,亲和力高;

4.对人的免疫原性弱。

纳米抗体的筛选和制备

1、纳米抗体基因文库的构建

抗原特异的纳米抗体可以通过免疫库、天然库或合成库产生,其中免疫库的构建常用的纳米抗体开发技术。

用纯化的靶抗原对羊驼进行免疫,免疫成功后在羊驼血液中提取包含成熟B细胞的淋巴细胞。抽提淋巴细胞的RNA并反转成cDNA文库,利用特殊设计的引物在cDNA文库中再次进行PCR扩增,得到特异的基因片段;随后将特异的基因片段拼接重组在噬菌体载体上,并转染大肠杆菌,最终完成纳米抗体基因文库的构建。

2、特异性抗体的筛选将靶点抗原或者带有抗原的物质直接/间接的固定在固体载体上,随后加入噬菌体文库和抗原相互作用。作用一段时间后阳性噬菌体会和抗原结合,用洗涤液洗涤固体载体表面,可以将未结合或非特异结合的噬菌体洗去。随后用强酸或者强碱破坏固体载体上抗原和阳性噬菌体的结合,从而得到阳性噬菌体溶液。一般重复进行2-3轮的筛选即可获得符合开发要求的纳米抗体克隆。

3、纳米抗体的生产制备

获得符合要求的抗体克隆后需要进行抗体的大规模生产制备。纳米抗体的生产制备是DNA转录到mRNA然后翻译成蛋白的过程。由于抗体具有复杂的结构,因此在表达体系中需要复杂的细胞器来完成正确的表达、折叠和加工。目前,在工业界有一系列成熟的表达体系可用于抗体表达,不同的表达体系之间各有优劣势差异。抗体设计的最优功能表达和纯化是决定它们实现应用命运的关键因素,因此选择合适的表达体系是获得最大收益的重要环节。

哺乳动物细胞系由于免疫原性低,且其细胞器可提供最优的折叠、分泌和翻译后修饰,是治疗性抗体的shou选表达系统,但同时存在生产成本高、技术难度大等缺陷;大肠杆菌表达体系由于其便利的生产和操作、快速的生产周期以及成熟的平台体系zui欢迎,然而,由于氧化氛围和折叠能力的限制,大肠杆菌不能表达具有复杂结构和富含二硫键的重组抗体;酵母是另一个普遍使用的微生物表达宿主,其结合了原核表达系统的优势(周期短、成本低、操作简单)和真核表达系统的优势(正确的折叠、修饰和分泌),使得它成为zui欢迎的可表达全长IgG或者其他抗体形式的宿主。还有其他一些系统可用于表达重组抗体,比如丝状真菌、藻类、原虫、昆虫细胞、转基因植物和动物,其中对转基因植物和动物的研究处于相对初始的阶段,需要进一步的深入研究。对于纳米抗体,由于其结构简单,水溶性较好,因此可以利用成本比较低的细菌表达系统和酵母表达系统进行大量生产。例如,比利时Ablynx公司建立了成熟的毕赤酵母表达和纯化工艺。纳米抗体在哺乳动物细胞系中生产鲜有报道,因为生产成本的昂贵会限制该体系的发展。在植物和动物体内进行纳米抗体生产也有大量的研究报道,跟传统抗体生产体系相似,这两种体系生产的纳米抗体具有成本低、污染少安全性高的特点,具有潜在的应用价值。

艾柏森纳米抗体亲和力成熟服务

纳米抗体可以通过天然抗体库、免疫抗体库或者合成抗体库筛选获得。通过不同方法制备的纳米抗体亲和力差异较大,在医疗诊断应用时常常要提高抗体的亲和力。艾柏森生物基于专业的噬菌体展示系统和酵母展示系统,应用独特的定点突变技术,构建大容量突变体文库,筛选出高亲和力的抗体,可提高亲本抗体10-100倍以上,达到nM级别。


纳米抗体亲和力成熟服务;Nanobody Affinity Matration Services


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