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酶切反应条件的优化

发布时间:2021-09-13   点击次数:47次

当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中,加入适量的DNA、内切酶和缓冲液,就可以获得最佳酶切效果。根 据定义,在50μl体系中,1单位的限制性内切酶可以在60分钟内完全切割1μg的底物DNA。上述酶、DNA与总反应体积的比值可以做为建立反应体系的 参考数据。但是,目前大多数科研人员会遵循下表中所列的标准反应条件,使用5-10倍的过量酶切割DNA,这样有利于克服由于DNA来源不同、质量和纯度 不同而造成的实验失败。

“标准"反应体系

1.jpg

内切酶

从冰箱取出后请一直置于冰上。

酶最后加入到反应体系中。

加入酶之前将反应混合物混匀,可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,然后在离心机中快速离心。切忌振荡混匀!

当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋DNA时,通常需要超过1unit/μg的酶量以达到完全酶切。

DNA

避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。

甲基化的DNA会抑制某些酶的切割效率。

缓冲液

使用终浓度为1X的缓冲液。

根据实验需要加入终浓度为100μg/ml的BSA(1:100稀释)。

在不需要BSA即可达到最佳活性的酶切反应中如果加入BSA也不会影响酶切效果。

反应总体积

建议在50μl反应体系中消化1μg底物DNA。

为避免星号活性,甘油浓度应<5%。

加入内切酶(贮存于50%甘油中)的量应不超过总体积的10%。

使用以下技术,内切酶的反应条件可能未达到最佳反应条件:克隆、基因分型、突变检测、基因定位、探针制备、测序和甲基化检测等。

内切酶贮存液中的添加物(如:甘油和盐)和底物溶液中尚存的残余物(如:盐、EDTA或乙醇)会导致小体积反应体系出现问题。NEB提供了一系列高保真内切酶(方便建立反应体系。下述为小体积反应体系反应指南。

酶切反应体系的选择

2.jpg

反应时间

标准一小时。

可加入过量的酶以缩短反应时间,或者使用能够快速酶切的内切酶。

对于许多酶,都可以用更少单位的酶消化16小时。

终止反应

若消化后的DNA不需要进行后续的实验操作:

用终止液终止反应【50%甘油、50mMEDTA(pH8.0)和0.05%溴酚蓝(NEB#B7021)】。按每50μl反应体系中加入10μl的比例进行。

若消化后的DNA需要进行后续的实验操作:

用热失活法。

利用商业化的离心柱或酚/氯仿抽提去除内切酶。

贮存

大多数内切酶建议保存在-20℃。只有少数内切酶若贮存时间超过30天建议保存在-70℃。详细的贮存信息请参阅内切酶使用说明书或目录。

10X反应缓冲液和BSA贮存液也应保存在-20℃。

不要将BSA直接加入到10X反应缓冲液中再冻存,因为这样BSA会产生沉淀。

稳定性

在任何情况下,都应尽可能的避免将酶置于高于-20℃的温度下。

对照反应

如果在切割底物DNA时遇到了问题,建议加入以下对照实验:

没有加入内切酶的实验DNA,以检测DNA制备和反应缓冲液中是否存在污染。

加入了内切酶的对照DNA(含有多个已知内切酶切割位点的DNA,如LambdaDNA或腺病毒-2DNA),以检测内切酶的活性。

如果对照DNA能够被切割而实验中的底物DNA不能,可以将这两种DNA混合在一起再进行酶切,以检测实验用的底物DNA中是否存在抑制反应的物质。如果确实存在某种抑制因子(通常为盐、EDTA或酚),则混合之后对照DNA也不能被切割。

注意:由于某些酶与DNA结合的亲和性非常高,所以不能很好地与产物分离。这样在进行琼脂糖凝胶电泳时就会出现弥散现象。若出现这种情况,可以在反应结束后加入终浓度为0.1-0.5%的SDS,带型会更加清晰。

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