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太赞了!质粒提取鉴定及保存

发布时间:2021-09-06   点击次数:56次

(1) 质粒的提取 (Tiangen质粒提取试剂盒):

a) 挑菌: 选取培养板中大小中等的单个菌落, 消毒牙签接种到10ml摇菌管中, 其中含有卡那霉素的LB约5ml, 37 °C, 220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。

b) 取上述2.0ml培养液, 于常温下12000 rpm离心1分钟, 弃上清, 干燥沉淀。

c) 加入250µl溶液P1(配有去RNA酶, 4 °C保存), 涡旋振荡, 完全悬浮细菌,不能留有沉淀, 否则会影响裂解。

d) 加入250µl溶液P2, 快速上下颠倒8次, 常温静置3分钟, 可见混合液逐渐变清、 粘稠, 表示已充分裂解。

e) 再加入350 µl溶液Ⅲ, 快速上下颠倒8次, 可见白色絮状物出现。

f) 常温12000rpm离心10分钟, 所得上清液倒入已经用BL平衡过的过滤柱中,注意不要倒入白色絮状物沉淀, 静置3分钟, 12000 rpm离心1分钟。

g) 加入500 µl溶液PD, 12000 rpm离心1分钟。

h) 加入600 µl溶液PW, 12000 rpm离心1分钟; 此步骤再重复1次; 弃废液后空管再次12000 rpm离心2分钟。

i) 于超净台通风干燥, 放置2-5分钟, 加入33µl已加热至65 °C的已灭菌的ddH 2 O, 室温静置3分钟, 12000 rpm离心2分钟, 得到相关质粒DNA, 测浓度, -20 °C保存备用。

(2) 质粒鉴定及保存

取100ng上述提取的质粒, 进行酶切(反应体系见前), 随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳以鉴定(方法同前所述), 最后将粗略鉴定正确的样本送至生物技术公司测序。 如测序正确, 用50%灭菌甘油300µl+700µl的菌液, 标记于-80 °C保存备用。

11) 质粒或PCR产物纯化(胶回收)

(1) 琼脂糖电泳酶切或 PCR 相关产物。

(2) 在紫外投射反射仪割取含有目的片段的琼脂糖凝胶片段, 割取要迅速, 以避免紫外线对 DNA 的损伤, 但注意尽量割取目的片段, 减少无目的片段的凝胶量, 以便提高纯化回收效率。

(3) 用天平称先称区空 EP 管重量, 再称取含有凝胶的 EP 管重量, 计算得到凝胶重量(mg), 加入等量体积(µl) Bindingbuffer(如 1 mg=1 μl)。

(4) 将含有凝胶的 EP 管置入 60 °C 恒温水浴箱中融化凝胶, 持续 8-10min,间或拿出摇匀, 以确保完全凝胶溶解。

(5) 将上述凝胶溶液转移至干净的纯化柱上, 室温下静置吸附 3 分钟。

(6) 将纯化柱 12000rpm 离心 1 分钟, 弃超滤液, 必要时可将超滤液重新离心1 次可提供纯化效率; 再次加入 100µl Binding buffer, 12000rpm 离心 1 分钟。

(7)加入 700µl Wash buffer (事先已经加入无水乙醇), 12000 rpm 离心 1 分钟,弃超滤液; 空管 12000 rpm 离心 2 分钟。

(8) 纯化柱置于 1.5 毫升干净离心管中, 于超净台通风干燥 5 分钟。

(9) 加入 30µl 已加热至 65 °C 的已灭菌的 ddH 2 O, 室温静置 3 分钟, 12000 rpm离心 2 分钟, 得到相应的 DNA 片段, 测浓度, -20 °C 保存备用。

艾柏森提供质粒测序服务


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