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抗体制备不论单还是多这些步骤要注意

发布时间:2021-06-21   点击次数:95次
   制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛选的工作量。因此,免疫抗原是越纯越好,应 根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说,抗原的来源有限,或性质不稳定,提纯时易变性,或其免疫原性很强,或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化 或分析等,免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中混杂物很多,特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与 免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度,这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
  多抗具有增强机体免疫功能和激活吞噬细胞,升高外周白细胞的作用,能提高骨髓造血机能和机体应激能力。
  抗体制备步骤
  1、免疫
  用生理盐水稀释免疫原,然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂,将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
  注:
  抗原注射以前需要收集一些正常血清,已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定,大概需要四天左右时间,可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。
  免疫用的抗原必须纯化,否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后,置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化,乳化过程比较费时、费力,但若乳化不充分,会影响免疫的效果,振荡后,1000rpm离心一分钟,如水相和油相不分层即可注射。免疫用FCA,以后都用FIA。
  免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射,每点注0.1ml,间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点,否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可,抗原用量大可以减少次数。
  2、取血:
  免疫一周后,可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低,头两次取血,够检测用即可。在三次免疫后,可以获得较价的抗体,每次取血量可以在40ml,不要取太多,否则会造成兔子贫血。
  前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血,室温过夜析出血清。
  一次取血可以采用颈动脉放血,具体操作如下:
  (1)、家兔仰卧于兔架上固定头部,用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。
  (2)、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约250px,分离皮下结缔组织,直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作,如碰到小血管出血,可用止血钳止血)。
  (3)、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织,暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离,剥离神经和结缔组织。
  (4)、于动脉下套入两根黑丝线,分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。
  (5)、用小拇指垫在血管下,用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断),插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上,以防放血管滑脱。
  (6)、松开止血钳,使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
  3、血清的分离
  如果用三角瓶或平皿盛血,将器皿倾斜放置于37oC烘箱2h,转移到4oC沉淀过夜,第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集,37oC烘箱放置2h,转移到4oC沉淀过夜,第二天早上离心,10000RCF,10分钟。在血清中加入NaN3 至终浓度0.02%,分装后-20oC保存。
  杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多,通常根据所研究的抗原和 实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报 告结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来,在融合之前就必须建立好抗体检测 方法,并克服可能存在的问题。
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