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单克隆抗体的纯化技术操作步骤

发布时间:2020-05-21   点击次数:178次

本文由艾柏森生物提供

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体,不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定,须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀,进行初步浓缩和纯化;可用亲和层析法进一步纯化。

一、腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前,一般均需对腹水进行预处理,目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法,以前者处理效果为佳,而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法

新鲜采集的腹水(或冻存的腹水),2000r/min 15分钟,除去细胞成分(或冻存过程中形成的固体物质)等;取上层清亮的腹水,等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水(VBS;0.004mol/L巴比妥,0.15mol/L NaCl,0.8mmol/L Mg2+,0.3mmol/L Ca2+)稀释;然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末,混匀,悬液在室温孵育30分钟,不时摇动;2000g离心20分钟,脂质等通过该法除去,即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法

用微孔滤膜过滤腹水,以除去较大的凝块及脂肪滴;用10000g 15分钟高速离心(4℃)除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法

即上述两法的组合,先将腹水高速离心,取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提

1、硫酸铵沉淀法

(1)饱和硫酸铵溶液的配制

500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中,加热至完全溶解,室温过夜,析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量,用2mol/L NaOH调PH至7.8。

(2)盐析

吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中,在搅拌下,滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml;继续缓慢搅拌30分钟;10000r/min离心15分钟;弃去上清液,沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮,搅拌作用30分钟,同法离心;重复前一步1-2次;沉淀物溶于1.5ml PBS(0.01mol/L PH7.2)或Tris-HCl缓冲液中。

(3)脱盐

常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱,以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液,流速每分钟1ml。蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3,1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟,用蒸馏水清洗透析袋内外表面,再用蒸馏水煮透析袋10分钟,冷至室温即可使用(并可于0.2mol/L EDTA溶液中,4℃保存备用)。将盐析样品装入透析袋中,对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析(4℃)12-24小时,其间更换5次透析液,用萘氏试剂(碘化gong11.5g,碘化钾8g,加蒸馏水50ml,待溶解后,再加20% NaOH 50ml)检测,直至透析外液无黄色物形成为止。

(4)蛋白质含量的测定

(Pr)(mg/ml)=(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数;或(Pr)=OD280×稀释倍数/1.3

(5)分装冻存备用

2、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行,适合于提纯IgG1和IgG2b,但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下:取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液,用1mol/L HCl调PH至4.8;按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例,室温搅拌下逐滴加入辛酸,于30分钟内加完,4℃静置2小时,取出15000g离心30分钟,弃沉淀;上清经尼龙筛过滤(125um),加入1/10体积的0.01mol/L PBS,用1mol/L NaOH调PH至7.2;在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度,作用30分钟,静置1小时;10000g离心30分钟,弃上清;沉淀溶于适量PBS(含137mmol/L NaCl,2.6mol/L KCl,0.2mmol/L EDTA)中,对50-100倍体积的PBS透析,4℃过夜,其间换水3次以上;取出10000g离心30分钟,除去不溶性沉渣,测定蛋白质含量后,分装,冻存备用。

3、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取,所获制品的抗体活性几乎保持不变,对IgG3单抗的回收率高于90%,对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下:取一定量的预处理过的腹水,先后加入NaCl和CaCl2,使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L,随之可见纤维蛋白的产生;经滤纸过滤后,滤液对100倍体积的去离子水透析,4℃ 8-15小时(若是IgG3单抗,也可室温2小时),其间换水1-2次;取出后22000g离心30分钟,弃上清;将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl,0.1mol/L Tris-HCl溶液中,重复上述的透析与离心;将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml,分装冻存备用。

三、单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种,应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法,常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。

1、离子交换层析:

分离蛋白质是根据在一定pH 条件下,蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂,后者为阴离子交换剂。

离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来

2、凝胶过滤法:

一定型号的凝胶网孔大小一定,只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部,大分子则被排阻在外。洗脱时,大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来,洗脱液体积小,小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去,历程长,后洗脱下来,洗脱体积大。

缺点:从凝胶过滤的原理可知,蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量,而是它的斯笃克半径,利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时,标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质,则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高,整个实验过程耗时很长。

3、免疫亲和层析法:

是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。

用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。

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