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蛋白异源表达纯化那些事儿

发布时间:2020-05-07   点击次数:88次

研究蛋白质功能、生产功能型蛋白质基本都离不开蛋白质的异源表达及纯化,今天小编将从以下几个方面与大家聊一聊蛋白质表达、纯化的那些事。

1、 标签选择

目前常见的表达标签有His-tag(组氨酸标签)、GST-tag(谷胱甘肽巯基转移酶标签)、MBP-tag(麦芽糖结合蛋白标签)、CBD-tag(几丁质结合区标签)等。每种标签都具有独特的性质,比如标签的分子量、对蛋白可溶性的调节能力、对蛋白折叠的影响、是否需切除等。根据自己要纯化的蛋白的特性,选择合适的标签。标签选的好,后续的实验事半功倍。

2、 载体构建

选好要用的标签后,就要准备构建表达载体了。目前已有很多商品化的载体可供选择,例如带His-tag的pET28系列,带MBP-tag的pMAL系列等。绝大多数的载体系列,都包含了标签插入N端或C端的形式,可以根据自己的蛋白的特质进行灵活选择。插入蛋白的编码基因时需要注意,不要出现移码。如果想要自己从头构建载体,别忘了插入合适的启动子和转录终止序列。启动子序列一般使用诱导型启动子,组成型启动子会导致外源蛋白过早表达积累,不利于宿主增殖。

3、 宿主选择

常见的宿主有大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母以及昆虫。以大肠杆菌来说,适合做异源表达的菌株为BL21及其衍生菌株,但仍需要根据载体中选择的转录、翻译元件来挑选。BL21中内源性的蛋白酶基因缺失,因此是一种适合于外源蛋白表达的菌株,但是它没有T7 RNA聚合酶,所以不能用于含T7启动子蛋白表达;BL21(DE3),在BL21的基础上整合了T7噬菌体基因组,适合T7表达系统,如pET系列;BL21(DE3)PLySs,在BL21(DE3)基础,附带了T7溶菌酶基因,可以更为严谨控制T7聚合酶的表达。需要注意的是,由于核酸内切酶(endA1)重组酶(recA1)等基因的存在,质粒在BL21系列菌株中不那么稳定,可能出现整合至基因组、丢失、突变等现象,所以构建好的载体仍需保存在DH5α之类的菌株中。

4、 培养条件优化

以大肠杆菌表达系统为例,菌种复苏和种子培养时都可以使用LB培养基,在发酵阶段使用氨基酸含量更高但糖源更低的培养基则更好,如TB培养基,以促进蛋白质的合成和积累。如果使用的是诱导型的启动子,则应在菌体生长至对数生长期后期时加入IPTG之类的诱导剂。加入诱导剂后,培养温度需要调低至16-30℃。培养温度越低,蛋白质累积的越慢,越不容易产生包涵体。

5、 纯化柱料选择

每一种标签都有对应的纯化柱料。GST-tag使用谷胱甘肽凝胶,MBP-tag使用多糖树脂,CBD-tag使用几丁质树脂,His-tag则使用偶联了二价金属离子的填料,其中常见的是偶联镍离子的,俗称镍柱。

NEBExpress镍柱填料(S1428S)于2019年11月全新上市,另有预装离心柱形式(S1427S/L),更适合做筛选阶段的小量蛋白纯化,纯化1mg His标记的蛋白质,只要15分钟。

每 1 ml 镍柱填料可纯化≥10 mg 组氨酸标签蛋白;

高特异性结合带有His-tag的蛋白质,分离和纯化后纯度>95%;

牢固的镍离子结合使其对 EDTA 和还原剂有极高的耐受性,与常见的基于去污剂的细胞裂解试剂兼容。

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