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技术服务 哺乳动物细胞双杂交服务

发布时间:2020-04-28   点击次数:68次

艾柏森(北京)生物科技有限公司

酵母双杂交检测实验技术服务

  随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展,为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势,已出现了很多新技术。其中酵母双杂交技术以其简便,灵敏,高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。

  蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础,研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验,同以往研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的实验手段相比,酵母双杂交系统具有其独特优势。

1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行,蛋白质保持天然的折叠状态,这是其他离体生化检验方法所缺乏的,它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。
2、双杂交系统的敏感度非常高,蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时都可以被侦测。
3、在筛选cDNA 文库时,双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列,它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白,省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。

 

酵母双杂交实验原理:

  以Gal4系统为例,BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时,DNA结合结构域与靶蛋白即"诱饵"相结合,转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下,单独的BD可以与GAL4上游活化序列(GAL UAS)结合但不能引起转录,单独的AD则不能与GAL UAS结合;只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时,BD与AD才能与GAL UAS结合并且引起报道基因的转录,从而激活下游报告基因,通过这一系列实验来验证两个蛋白之间的相互作用。

 

★ 酵母单/双杂交检测服务项目列表

 

服务项目

说明

周期

服务报价

酵母单杂交文库构建技术服务

基于重组方法的文库构建方案(请参考本页详细说明)

4-6周

请联系

客服

酵母单杂交文库筛选技术服务

DNA—蛋白质相互作用(请参考本页详细说明)

12-15周

核蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务

基于pDEST22或pGADT7系统

14-16周

膜蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务

基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统

14-16周

 

服务一、酵母单杂交文库构建服务

  酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中,识别与DNA特异结合的蛋白质,同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列,而无需分离纯化蛋白,实验简单易行。为了获得良好的酵母单杂交筛选实验结果,构建酵母单杂的文库至关重要,我们可以依据不同的实验需要及物种特性,选择不同的体系建库方法,我们的技术专家可以熟练的应用Clonetech的SAMRT方法和life的gateway方法建立,同时,我们的技术专家也开发出了基于同源重组原理的建库方法。

 

★ 酵母单杂交文库构建实验流程: 
 1. RNA提取 
 2. mRNA提取 
 3. cDNA的酶促法合成
 4. cDNA连接接头 
 5. cDNA按长度分离 
 6. cDNA与酵母单杂交文库载体pGADT7进行all-direct重组 
 7. 重组产物电转化 
 8. 文库检测以及质粒提取

 

★ 酵母单杂交文库构建实验材料要求: 

客户构建指定的酵母单杂交cDNA文库,由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可:

细胞样本:细胞数量大于1*10^7;

动物样本:大于1g;

植物样本:大于2g;

总RNA:大于200ug。

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