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慢病毒构建稳转细胞系——艾柏森生物

更新时间:2024-06-18点击次数:258


 

慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒,属于慢病毒属,其特点是能够感染分裂和非分裂的细胞,并且具有较长的潜伏期。慢病毒载体因其高效的转导效率和较低的免疫原性,被广泛应用于基因治疗和生物医学研究中。构建慢病毒稳转细胞系是现代生物技术研究中的一个重要步骤,以下是构建慢病毒稳转细胞系的一般步骤:

 

目标基因的选择与克隆:首先,需要确定你想要稳定表达的目标基因,并将其克隆到慢病毒载体中。慢病毒载体通常包含启动子、目的基因表达框、polyA信号等元件。

 

载体构建:将目标基因克隆到慢病毒载体中,构建重组慢病毒载体。这通常涉及到限制性内切酶切割、连接酶连接等分子克隆技术。

 

共转染产生病毒颗粒:将重组慢病毒载体与包装质粒(如gag/polrevvsv-g等)共转染到宿主细胞中,如HEK293T细胞,以产生具有感染能力的慢病毒颗粒。

 

病毒颗粒的收集与浓缩:转染后48-72小时,收集含病毒颗粒的培养基,通过超速离心等方法进行浓缩,以提高病毒滴度。

 

病毒感染细胞:将浓缩的病毒颗粒与目标细胞共培养,使病毒整合到宿主细胞基因组中。可以通过观察绿色荧光蛋白(GFP)等报告基因的表达来评估感染效率。

 

筛选稳转细胞:感染后,通过抗生素筛选(如嘌呤霉素、新霉素等)或其他筛选标记,筛选出稳定表达外源基因的细胞克隆。

 

单克隆培养:将筛选出的稳转细胞进行限制稀释,形成单克隆,以确保细胞群体的均一性。

 

扩增与鉴定:对单克隆细胞进行扩增培养,并进行分子生物学鉴定,如PCRWestern blot等,以确认目标基因的整合和表达。

 

功能研究:利用构建好的稳转细胞系进行后续的功能研究,如药物筛选、信号通路分析、疾病模型建立等。

 

长期保存:将稳转细胞系冻存于液氮中,以备后续使用。

构建慢病毒稳转细胞系是一个复杂的过程,需要精确的实验设计和严格的实验操作。此外,由于慢病毒的潜在致病性,实验过程中还需遵循相关的生物安全规范。通过这一过程,研究人员可以获得稳定表达特定基因的细胞模型,为疾病机理研究和药物开发提供重要的实验工具。

 


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