欢迎来到安诺伦(北京)生物科技有限公司网站!

热门关键词:抗体类,蛋白类,分子细胞类,化学品与试剂

产品中心PRODUCTS
技术文章您现在的位置:首页 > 技术文章 > 干货分享!比一比,分选细胞您需要多长时间?

干货分享!比一比,分选细胞您需要多长时间?

发布时间:2021-11-08   点击次数:104次

细胞分选在多种研究领域都有涉及,例如肿瘤学,神经生物学,免疫学等。上次和大家分享了磁珠分选,除了磁珠分选还有流式分选,今天小编在这里跟大家聊一下流式分选的原理、应用及与磁珠分选的区别,希望能帮到大家一二。


1

流式细胞仪分选原理

流式细胞仪分选细胞有两种方法:一是“Catch Tuber"即“捕获管法"就是机械手臂以极快的速度出入样品液流,在细胞通过激光照射并被确认之后快速捕获目标细胞至收集系统中,此种方法常用于小型台式机。另一种方法是电子偏转的方式,即将荧光染色确认的细胞标记正或负电荷,通过电磁场偏转而分离,此种方法常用于大型科研型机器。

电子偏转示意图

操作流程

(1)先制备单细胞悬液(可检测多种样本的单细胞悬液:外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞等)

(2)样本染色

①核酸标记:通过核酸染料DAPI、PI等与核酸(DNA)结合,核酸含量越高,结合的染料越多,故可以通过核酸染料的多少以及强弱进行细胞周期分选。

②蛋白标记:偶联荧光素的单克隆抗体与细胞表面/胞内的抗原结合,结合的量越多,荧光信号就越强。

③荧光报告蛋白:很多报告蛋白是荧光蛋白(GFP、DsRed等),可成为流式检测时荧光信号的来源。

(3)细胞分选

鞘液和样品流进入喷嘴后,在电磁传感器产生的高频振荡下,形成稳定的液滴,然后将荧光染色确认的细胞标记正或负电荷,通过电偏转而分离。

(4)分选后细胞可进一步做分子生物学研究,如荧光定量PCR、western blot、细胞培养等。

2

影响流式分选的因素

分选中我们一般都关心分选速度、分选纯度、分选得率、分选活性。

(1)如何提高分选速度:

振荡频率、鞘液压力、喷嘴大小、上样速度

-振荡频率越高,分选速度越快;

-振荡频率越高,鞘液压力也随之增加;

-若要形成稳定液滴,最佳振荡频率:f=V/(4.5d);

-鞘液压力和喷嘴大小一定时,振荡频率相对固定。

-上样速度过快,得率会降低,故最佳上样速度=1/4*f

(2)如何提高分选纯度:

-精确设定液滴延迟时间(Drop Delay):指细胞通过激光检测区到液滴分离断电位置的间隔时间。

-保证液流稳定:鞘液和样品流进入喷嘴后,在电磁传感器产生的高频振荡下,形成稳定的液滴,即液流的断点位置维持在一个固定的位置。

-选择合适的分选模式

-排除样本粘连

-合理设门(用散点图)

-合理阈值设定

(3)如何提高分选得率:

- Drop Delay液滴延迟时间要准确,液流稳定

-如果不考虑纯度的情况下(不需后续培养),可以选择Enrich/yield分选模式

(4)如何提高分选活性

-与细胞本身的活性有关

-与仪器洁净程度有关

-与鞘液压力、喷嘴大小有关(对于脆弱细胞,尽量采用低压和大喷嘴,包裹细胞的液滴越大,对细胞的冲击越小)

-与上样管路设计及管壁光滑程度有关

3

流式分选和磁珠分选的比较

总结:二者各有优势,不能相互取代。

磁珠分选的优势:

-操作简单、分选速度快、细胞活性好。

流式分选优势:

-多参数分选,不同荧光强度的分选。

二者相互结合,可用于分选比例较低的细胞群。例如要分选人的造血干细胞CD43+CD38-,可以先用磁珠分选富集CD34+细胞,再结合流式分选出CD34+CD38-造血干细胞。

4

流式分选的应用

(1)流式分选在干细胞研究中的应用

2013年6月,上海中科院生化所李劲松组、神经所孙强组与健康所金颖组合作,建立来自食蟹猴孤雌囊胚的单倍体胚胎干细胞系,发表在Nature子刊Cell Research上,文中单倍体分选涉及到流式分选。

(2)流式分析在染色体分析分选中的应用

瑞士的一组研究人员建立起一套符合GMP标准的大规模体外扩增异体反应性NK细胞用于AML治疗的实验流程,采用经GMP认证的BD Influx分选出单一KIR(killer lmmunoglobulin-like Receptor)特异性的NK细胞,

(3)流式分析在荧光蛋白分选中的应用

将CFP基因插入到Abcg2基因得到基因改造小鼠,流式分选Abcg2/GFP+骨髓细胞,并移植入小鼠体内检测造血能力,发现:Lin-GFP+细胞显著富集造血干细胞,Lin-GFP-细胞无造血能力。

好了,今天小编给大家详细的介绍了流式分选的原理、应用及与磁珠分选的区别,希望对大家以后的实验有用。


在线客服
电话咨询 18915310964
在线客服