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拿来吧你,拯救你的重组蛋白

发布时间:2021-08-13   点击次数:93次

重组蛋白是应用了重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质。用于生产重组蛋白的宿主细胞主要是细菌(大肠杆菌)、哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母。重组蛋白已被广泛应用于蛋白结构研究、免疫检测试剂、重组蛋白药物、诊断试剂开发、抗体药物靶点、CAR-T细胞治疗靶点、Fc受体、流感病毒蛋白和细胞因子等大多数热门研究领域。

那大家在进行重组蛋白表达时不知道会不会纠结这些问题:该选择什么表达系统?蛋白产量怎么才能有所提高?                      

接下来带你们了解一些常见的外源基因表达系统(包括原核、真核表达系统)以及一些提高蛋白产量的方法。


原核表达系统(主要包括大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统),真核表达系统(主要包括哺乳动物细胞表达系统,酵母表达系统,昆虫表达系统)。


酵母表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工能力,有利于真核蛋白的表达,特有的 AOX 强效启动子使得外源基因表达量很高,而且酵母的培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,非常适合大规模工业化生产,另外用甲醇代替 IPTG 作为诱导物,部分甲醇酵母以甲醇等工业产物代替葡萄糖作为碳源,生产成本非常低。


但是酵母在表达外源基因时会造成产物蛋白的不均一、降解、信号肽加工不完全、多聚体形成等问题。


杆状病毒做为外源基因表达的宿主,由于其可以对真核蛋白进行翻译后加工等过程而被广泛地用于真核基因的体外表达。

体外重组蛋白表达系统主要分为真核表达系统和原核表达系统。其中原核表达系统以大肠杆菌表达为主,也是目前应用最广泛最多的表达系统。真核表达系统分为:哺乳动物细胞表达,酵母表达系统和昆虫表达系统。


真核系统和原核系统各自优缺点:



其中哺乳动物细胞表达又分为哺乳动物细胞瞬时转染表达和稳定细胞系构建,重组抗体生产。酵母系统又分为毕赤酵母表达和酿酒酵母表达。针对真核表达系统来说,哺乳动物细胞和酵母表达较为常用。


虽然杆状病毒表达系统能够对目的蛋白做翻译后修饰,但这种修饰存在着一定的限度; 虽然其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样,但寡糖链的性质有所不同,无法产生复杂的糖基侧链,这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中类似的形式。


哺乳动物细胞自身具备蛋白折叠和翻译后修饰的功能,其表达的重组蛋白在分子结构、理化性质和生物学功能方面zui接近于天然的高等生物蛋白质分子,更有可能获得与天然分子相同的生物活性。





提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率可以从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质、高密度发酵等方面着手。



启动子及其他载体元件能够显著影响目的基因转录的强度与持续性,进而影响目的蛋白产率。合适的启动子应当具有以下三个特征:①能够实现目的基因的高效表达(通常使目的蛋白占菌体总蛋白质的10% ~50%) ;②减少本底表达,防止本底表达的目的蛋白对宿主对数生长期造成负面影响;③诱导方法简单、经济。


SD序列可以减少 mRNA 形成,能够降低翻译效率,因此对形成翻译起始复合物,有效地进行蛋白质翻译是必需的。


大肠杆菌周质空间中蛋白质的种类少、数量低,且蛋白酶含量也较低,因此目的蛋白在周质空间中的表达有利于分离纯化和减少蛋白酶的降解。


目的蛋白被转运至周质空间过程中信号肽被酶切,且氧化性的周质空间有助于目的蛋白的正确折叠与正确构象的维持。具有不同特性的工程菌对重组蛋白的可溶性表达具有重要意义,目前已有多种商品化的大肠杆菌株能够协助重组蛋白的可溶性表达。


具有不同特性的工程菌对重组蛋白的可溶性表达具有重要意义,目前已有多种商品化的大肠杆菌株能够协助重组蛋白的可溶性表达。


哺乳动物表达系统主要通过调节影响细胞生长的参数(比如pH、C02浓度、离子强度和细胞密度,培养基等)和利用基因工程的方法(通过在表达载体上插入强启动子或增强子来增加转录水平)提高蛋白表达量。



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