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多克隆抗体的制备总结

发布时间:2021-07-30   点击次数:84次

多克隆抗体的制备
1. 器材:
剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把,手术刀架,手术刀片,注射器(1ml、10ml,25ml)附针头,兔子固定架,灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把,直头止血钳两把,手术缝合线,塑料放血管,纱布等。


2. 试剂:
生理盐水(或PBS),
弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant, FCA) Sigma F-5881,
弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506,
二甲苯,酒精棉,脱脂棉,2% NaN3


3. 兔子的选择:
兔子的重量应在四斤以上,两耳光滑,明显可见耳静、动脉,健康。


4. Pre-bleeding:
抗原注射以前需要收集一些正常血清,已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定,大概需要四天左右时间,可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化,否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后,置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化,乳化过程比较费时、费力,但若乳化不充分,会影响免疫的效果,振荡后,1000rpm离心一分钟,如水相和油相不分层即可注射。第一次免疫用FCA,以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射,每点注0.1ml,间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点,否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可,抗原用量大可以减少次数。
免疫一周后,可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低,头两次取血,够检测用即可。在三次免疫后,可以获得较高效价的抗体,每次取血量可以在40ml,不要取太多,否则会造成兔子贫血。最后一次取血可以采用颈动脉放血,具体操作如下:
a.家兔仰卧于兔架上固定头部,用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤;
b.沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm,分离皮下结缔组织,直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作,如碰到小血管出血,可用止血钳止血)
c.用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织,暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离,剥离神经和结缔组织;
d.于动脉下套入两根黑丝线,分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住;
e.用小拇指垫在血管下,用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断),插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上,以防放血管滑脱;
f.松开止血钳,使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

5. 血清的分离:
如果用三角瓶或平皿盛血,将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr,转移到4oC沉淀过夜,第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集,37oC烘箱放置2hr,转移到4oC沉淀过夜,第二天早上离心,10000RCF,10分钟。在血清中加入 NaN3 至终浓度0.02%,分装后-20oC保存。

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